免疫系統可以在前期抑制腫瘤的發生，但是隨著腫瘤的發展，腫瘤細胞可以通過多種機制抑制免疫系統，實現「免疫逃逸」。
想要清楚腫瘤免疫和免疫逃逸的發生過程，就需要明確腫瘤組織中免疫細胞的功能狀態及其相對于腫瘤細胞的組織結構。
【資料圖】
來自哈佛大學的 Sandro Santagata 團隊嘗試使用「空間定量分析」，即使用高度精確的空間剖面搭配一套分析和計算方法，以期確定以下幾點：
（1）免疫細胞、腫瘤細胞和基質細胞的特性和分子特征；
（2）影響這些細胞類型和空間組織的物理、化學因素；
（3）生成腫瘤對治療反應隨時間和空間的動態變化。
研究者以 Kras/Trp53 突變 (KP) 的基因工程小鼠模型（GEMM）為原型，通過氣管內給與編碼 Cre 重組酶的慢病毒來刺激腫瘤的發生，并將該模型命名為 KP-Cre。該模型會在每個二維肺橫截面產生 10-15 個腫瘤結節，并在 1-5 個月內完成從增生到腺癌的過程。
首先，研究者使用多模式數據集成對小鼠模型的腫瘤微環境進行初步分析
研究者在給 KP GEMM 小鼠氣管內遞送腫瘤起始慢病毒之后對小鼠進行免疫治療。腫瘤生成 6-9 周后，分別使用 H&E 染色、mRNA 原位雜交（ISH）和 24 倍循環免疫熒光（CyCIF）對腫瘤的甲醛固定石蠟包埋（FFPE）組織連續切進行分析。
在 CyCIF 分析中，研究者將識別出腫瘤組織中的單個細胞，并對單個細胞的染色強度進行量化，利用單個細胞相對于腫瘤結節、邊緣和血管的距離，構建出「細胞網絡圖形」（圖 1）。
圖 1：小鼠腫瘤組織內部 H&E、mRNA 和 CyCIF 分析的圖像結果
接著，研究者使用特定抗原刺激腫瘤的免疫系統
由于 KP-Cre 小鼠腫瘤體細胞突變負荷較低，新生抗原較少，腫瘤免疫未能高效激活。為了激活腫瘤免疫，研究者在腫瘤細胞中引入了兩種 CD8+T 淋巴細胞抗原：雞卵清蛋白 SIINFEKL（SIIN) 和合成肽 SIYRYYGL（SIY）。引入抗原后的模型被命名為 KP-LucOS。
相比較 KP-Cre 小鼠模型，KP-LucOS 小鼠模型的腫瘤生長得到了明顯抑制。
對腫瘤微環境的分析發現，雖然兩種小鼠模型的腫瘤組織中浸潤免疫細胞并沒有顯著差異，但是非腫瘤組織中浸潤的免疫細胞有很大不同。
相比 KP-Cre 小鼠模型，KP-LucOS 模型的非腫瘤組織中浸潤的自然殺傷細胞（NK）、輔助 T 淋巴細胞（Th）和細胞毒 T 淋巴細胞（Tc）以及 CD103+樹突狀細胞（DC）增加了 3.3-8 倍，這可能是腫瘤抑制的原因之一（圖 2）。
圖 2：KP-Cre 和 KP-LucOS 模型腫瘤免疫微環境的不同
然后，研究者在腫瘤組織中鑒定出淋巴細胞網
通過對每個樣本單獨進行 Delaunay 三角測量，研究者繪制出了細胞之間的位置關系圖譜，進而在腫瘤組織中確認出一個個淋巴細胞網（Lymphonet），既有由不到 10 個淋巴細胞小簇組成的，也有由多余 100 個直接接觸的淋巴細胞組成的。
淋巴細胞網的大小和其細胞成分之間存在一定關系，越大的淋巴細胞網會有越多的 B 淋巴細胞。而且，小于 16 個細胞的淋巴細胞網基本不存在 B 淋巴細胞。這個提示，淋巴細胞網起初由 T 淋巴細胞組成核心，隨后通過募集 B 淋巴細胞生長（圖 3）。
圖 3：腫瘤組織中的淋巴細胞網及其構成細胞特點
隨后，研究者發現 CXCR3 配體參與調節淋巴細胞網的形成
已知 CXCL9 和 CXCL10 趨化因子（以及人類的 CXCL11）與 CXCR3 受體的結合可以介導 T 淋巴細胞在腫瘤微環境中的募集，而淋巴細胞網主要由 T 淋巴細胞組成，因此研究者推測 CXCR3 啟動了淋巴細胞網的形成。
研究者使用 CRISPR 激活法在 KP-Cre 小鼠腫瘤中異位表達 CXCL10，成功使 CXCL10 在 mRNA 水平增加了 38 倍。
而在高表達 CXCL10 之后，淋巴細胞網的數量和大小顯著增加，并促進了 B 淋巴細胞和所有 T 淋巴細胞亞群的募集。這說明，CXCL10 在腫瘤微環境中的表達可以促進淋巴細胞網的形成和生長（圖 4）。
圖 4：腫瘤微環境中的 CXCL10 的轉錄可以促進淋巴細胞網的形成
之后，研究者確認了淋巴細胞網在腫瘤免疫中的角色
研究者分別使用兩種免疫治療方法治療 LucOS 小鼠：
（1）接種針對 SIIN 和 SIY 抗原的治療性疫苗（Vax）；
（2）注射靶向 PD-1/CTLA-4 的免疫檢查點抑制劑（ICB）。
Palantir（一種使用多維表達數據沿著分化軌跡排列單細胞的算法）分析所得數據可以對細胞類型和狀態進行劃分，將 T 淋巴細胞狀態分為：S1 未成熟狀態；S2A 增殖性/細胞毒性狀態；S2B 細胞毒性/早期衰竭狀態；S3 衰竭/功能障礙狀態以及三種過度狀態（T1-3）。據此可以檢測兩種免疫治療對誘導 Tc 狀態的影響。
分析發現，在未經治療的 LucOS 小鼠中，大多數 Tc 細胞是未成熟（幼稚）狀態（S1）。但 Vax 和 ICB 治療可以將淋巴細胞轉化為腫瘤免疫作用更強的細胞毒性（S2）和耗竭（S3）狀態。
通過組織定位分析發現，代表增殖/細胞毒性的 S2A 狀態往往在距離腫瘤較遠的位置募集，而代表細胞毒性/耗竭的 S2B 狀態在腫瘤內部更多。這提示，S2A 狀態的淋巴細胞在腫瘤遠端形成后遷移到腫瘤內部，參與了腫瘤免疫的過程，最終轉化為 S2B 狀態。
通過流式細胞術對兩種免疫治療后 SIIN 和 SIY 特異性的 Tc 細胞進行分析，結果發現 Vax 可以更好的促進 SIIN 和 SIY 特異性 T 淋巴細胞的激活，而 ICB 會額外作用于其它 Tc 群體。這些額外激活的 Tc 細胞可能對腫瘤相關抗原有反應，也可能是對非腫瘤相關抗原產生反應。
進一步分析發現，具有細胞毒性潛力的細胞與淋巴細胞網中的 TCF1+PD-1+祖細胞存在共定位。而已知 TCF1+PD-1+祖細胞會在在腫瘤組織中轉化為 Tc 細胞，這表明祖細胞可以在淋巴細胞網中分化成熟為 Tc 細胞以響應免疫治療（圖 5）。
圖 5：淋巴細胞網在腫瘤免疫中的作用
最后，作者在人類肺腺癌組織中進行了驗證
人體組織的分析結果發現，在 KP-GEMM 模型中鑒定出的淋巴細胞網在人類肺腺癌組織中也大量存在，并且特征和動物模型相似。這提示淋巴細胞網在人體腫瘤組織中支持祖細胞 CD8+T 淋巴細胞成熟方面具有類似的功能（圖 6）。
圖 6：人肺腺癌組織中的淋巴細胞網
本文的結果發現，免疫細胞在對腫瘤抗原發生反應時，其空間排列會發生顯著變化。T 淋巴和 B 淋巴細胞在「淋巴細胞網」 中被募集，其中包含祖 T 淋巴細胞。在免疫治療后，祖細胞可能會在「淋巴細胞網」 獨特的免疫環境中分化和激活，進而產生細胞毒性 T 淋巴細胞，最終參與腫瘤的免疫過程。
點評專家
點評內容
在腫瘤免疫微環境中，免疫細胞和腫瘤細胞如何相互作用一直是腫瘤免疫研究的熱點。但作為抗腫瘤免疫應答主力軍的 T 細胞和 B 細胞，如何在空間結構上相互協作發揮抗腫瘤的作用，我們亦所知甚少。
日前，來自哈佛大學的研究小組在 Cancer Cell 上發表文章，報道了主要由 T、B 細胞形成的「淋巴細胞網」結構（Lymphonet），在 PD-1 單抗或腫瘤疫苗刺激下，可作為「士兵培訓基地」大量產生細胞毒性 T 細胞，介導免疫監視。這一研究發現并命名了一個新的免疫系統結構 ——「Lymphonet」，揭示了 Lymphonet 在抗腫瘤免疫應答中的功能及形成的分子機制，為免疫治療提供了新的 biomarker 及潛在的治療靶點。
值得注意的是，Lymphonet 與既往發現的免疫檢查點抑制劑療效正相關的三級淋巴樣結構（TLS），存在較多相似性，但 TLS 發育的成熟程度及在不同類型的腫瘤中均存在較大異質性，研究者通過動態觀察也有同樣疑問：「Lymphonet」是否可能為 TLS 的前體，這將為 TLS 研究開啟新的方向。
另外，研究發現腫瘤疫苗可同時活化兩種類型的 T 細胞：S2A 型以及 S2B ?型，而 PD-1 單抗僅活化 S2B ?型，同時空間共定位發現 S2B 型細胞更多聚集于 Lymphonet。這進一步證實 PD-1 單抗可能是通過活化耗竭前體 T 細胞（TCF-1+PD-1+T 細胞，也聚集于 Lymphonet）發揮抗腫瘤免疫應答的機制。有意思的是腫瘤疫苗不僅活化了 S2B T 細胞，還可活化具有殺傷和增殖功能的 S2A 型細胞，而該細胞聚集于腫瘤遠處，猜想可能來自外周循環。因此，該研究也為腫瘤疫苗與免疫檢查點抑制劑的聯合治療提供了新的思路。
參考文獻：
Gaglia G, Burger ML, et?al. Lymphocyte networks are dynamic cellular communities in the immunoregulatory landscape of lung adenocarcinoma. Cancer Cell. 2023 Apr 8:S1535-6108(23)00088-0.
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